DIVERSIDADE DE PEPTÍDEOS EM SEMENTE COFFEA CANEPHORA

Resumo

Todos os organismos vivos evoluíram diferentes mecanismos constitutivos ou induzidos para se protegerem contra patógenos. Numerosos compostos que conferem resistência a microrganismos foram identificados nas plantas, entre elas as proteínas e peptídeos com atividade antimicrobiana. Neste estudo, nós investigamos a diversidade de peptídeos em sementes de Coffea canephora a partir da metodologia descrita por Egorov et al., 2005.Inicialmente, as sementes foram maceradas com N2 liquído até obter uma farinha. A esta foi adicionada éter de petróleo 1:10 (farinha-éter), por 1 h a 25° C. Os peptídeos foram extraídos com uma mistura de 1% (v/v) de trifluoracético (TFA), 1M HCl, 5% (v/v) ácido fórmico e 1% NaCl na presença de pepstatina A (1µg/ml) na proporção de semente solvente 1:4. O extrato protéico obtido foi diluído em 0.1% (v/v) TFA e submetida à uma coluna de fase reversa C8 acoplada a uma coluna C18 (coluna analítica Shim-pack CLC-ODS, Shimadzu-Japão) em HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Shimadzu-Japão usando um gradiente linear de propanol. A purificação foi acompanhada por técnicas de eletroforese.No perfil cromatográfico da semente de C. canephora foram selecionadas frações protéicas a partir dos valores de A280, onde foram nomeadas por P1,P2,P3,P4 e P5. Através da análise por SDS-Tricina-PAGE, as frações selecionadas revelaram 5 principais proteínas com massas moleculares entre 6 à 13 kDa. A técnica de Western blotting realizado com anticorpo de coelho produzido contra uma proteína transportadora de lipídeo (LTP) de C. canephora, previamente produzido por nossa equipe, demonstrou a viabilidade da metodologia de extração e purificação para peptídeos dessas sementes.Com a técnica empregada verificou-se a presença de diferentes peptídeos em sementes de C. canephora, que podem exercer atividades de defesa como já caracterizado para algumas LTPs isoladas. Os peptídeos serão submetidos à seqüência de aminoácidos para identificação e atividade antimicrobiana.