DETERMINAÇÃO DO MÉTODO DE EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS PARA ANÁLISE EM ELETROFORESE BIDIMENSIONAL EM CULTURAS EMBRIOGÊNICAS CANA-DE-AÇÚCAR

Autores

  • Maria Fernanda Ribeiro Dias
  • Tatiana Barroso Chiquieri
  • Vanildo Silveira

Palavras-chave:

cana-de-açúcar, extração de proteínas, proteômica

Resumo

Em culturas celulares de plantas a quantidade de interferentes e baixa concentração de proteínas representam fator limitante para análise proteômica, sendo portanto fundamental a otimização dos métodos de extração protéica, visando à redução de interferentes e, possibilitando a aplicação de técnicas como a eletroforese bidimensional (2-DE). O objetivo do trabalho foi analisar três diferentes métodos de extração de proteínas em culturas de cana-de-açúcar (Saccharum sp.), para aplicação da 2-DE.Foram utilizadas culturas embriogênicas de cana-de-açúcar da cultivar SP81-3250, mantidas em meio de multiplicação MS (Murashige e Skoog, 1962), suplementado com ácido 2,4-diclorofenoxiacético (10 µM), sacarose (20 g.L-1) e phytagel® (2 g.L-1). Amostras de 500 mg de matéria fresca (MF) foram submetidas aos seguintes métodos de extração: uréia/tiouréia (1), precipitação em TCA/acetona (2), e tris-fenol (3). A concentração protéica foi determinada pelo 2D-Quant-Kit (GE HealthCare), usando albumina de soro bovino como padrão. Alíquotas de 600 ?g de proteínas foram submetidas à eletroforese bidimensional (2-DE). Os géis obtidos foram corados com coomassie coloidal e prata.Dentre os métodos de extração analisados foi possível detectar uma diferença qualitativa relacionada à resolução e a detecção de “spots”. Sendo o método de extração com TCA/acetona, o mais adequado para a amostra, apresentando uma melhor resolução, e, proporcionando identificação visual de um maior número de “spots”. O método de extração com uréia/tiouréia apresentou uma menor resolução e um menor número de “spots” identificados, devido provavelmente aos interferentes contidos na metodologia de extração. Dentre os três métodos estudados, a extração com tris-fenol, mostrou-se inapropriada para a amostra, considerando-se a não detecção dos “spots”.O presente estudo aponta para uma maior eficiência da extração com TCA/Acetona em tecidos vegetais, de cana-de-açúcar quando comparado as extrações com uréia/tiouréia e tris-fenol.

Publicado

08-03-2012