SUPEREXPRESSÃO EM ESCHERICHIA COLI DE UMA DEFENSINA OBTIDA DE FEIJÃO-DE-CORDA E PADRONIZAÇÃO DE SUA PURIFICAÇÃO

Autores

  • GÉSSIKA SILVA SOUZA
  • LUANA BURGOS QUIRINO DA SILVA
  • VALDIRENE MOREIRA GOMES
  • ANDRÉ DE OLIVEIRA CARVALHO

Palavras-chave:

Defensina, Superexpressão, Padronização da purificação

Resumo

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são componentes da imunidade inata dos organismos. Pesquisadores apontam que eles possuem grande potencial biotecnológico a ser explorado como novas drogas. As defensinas são AMPs pequenos, básicos, ricos em cisteínas e que possuem atividade antimicrobiana. O objetivo é estudar os efeitos antimicrobianos da defensina recombinante de sementes de feijão-de-corda (Vigna unguiculata L.) contra Leishmania sp. e Trypanosoma cruzi.E. coli contendo o plasmídeo pET-DEF foi inoculada em caldo LB e incubada por 16 h a 37°C. Uma parte do pré-inoculo foi transferida para o mesmo meio e incubada nas mesmas condições até a DO600 atingir 0,5-1. Então se adicionou IPTG 1 mM e a cultura foi incubada a 30°C por mais 3 h. Para a extração da defensina as bactérias foram centrifugadas (10.000 g/10 min) e sonicadas (5 pulsos de 20 s), o sobrenandante foi novamente centrifugado (10.000 g/10 min) e então utilizado para padronização da purificação nas colunas, Ni-Sepharose 6 fast-flow (GE), Ni-NTA superflow cartridge (Qiagen) e Ni-NTA agarose (Qiagen), as cromatografias foram feitas segundo o manual de instrução fornecido com as mesmas.As condições de indução foram eficientes e o extrato total da bactéria mostrou uma banda superexpressa com massa correspondente à defensina recombinante. Esta amostra foi utilizada para a etapa de purificação da defensina recombinante por técnicas cromatográficas em cromatografia de afinidade a Ni. As coluna de Ni-Sepharose 6 fast-flow (GE) e Ni-NTA superflow cartridge (Qiagen), já testadas, apresentaram picos não retidos, referente às proteínas do extrato bacteriano e picos retidos e eluídos com imidazol, referentes às proteínas que tem afinidade ao Ni. As amostras foram dialisadas, o conteúdo protéico foi dosado por Bradford e estas foram acompanhadas por eletroforese em gel de Laemmli.Os resultados mostram que as condições de indução da defensina recombinante foram eficientes e que as duas colunas já utilizadas apresentaram resultados insatisfatórios em relação à homogeneidade da defensina recombinante recuperada. A terceira coluna de Ni-NTA agarose (Qiagen) está sendo testada.

Publicado

29-03-2012