ATIVIDADES DE PROTEINASES CISTEÍNICAS E MORTE CELULAR PROGRAMADA (MCP) EM TEGUMENTOS DE SEMENTES QUIESCENTES

Resumo

Células vegetais sofrem processos particulares de MCP relacionados com autofagia. Apesar disso, atividades caspase-símile, frequentemente de proteases cisteínicas, têm sido relatadas em tecidos de diferentes espécies vegetais com o uso de substratos e inibidores de caspases. Esse trabalho visa o diagnóstico dessas atividades e o estudo de MCP nos tegumentos de sementes quiescentes de Albizia sp., Cicer arietinum e Lens culinaris, onde os aspectos de MCP merecem uma melhor compreensão.Tegumentos das sementes foram removidos, processados e proteínas extraídas por tampão de extração e centrifugação. O teor protéico das amostras foi medido e foram realizados ensaios de atividade de proteases cisteínicas em pH 5,6 com azocaseína, tendo papaína como controle. Eletroforeses foram executadas (Laemmli, 1970) em gel a 15% com amostras fervidas de 2 a 15 minutos e sem fervura. Géis de atividade (SDS-PAGE-gelatina) foram incubados com ativadores de proteases cisteínicas. Foram feitos ensaios enzimáticos com substratos sintéticos das caspases 3 e 6, e na presença de inibidor de caspase 3, após precipitação protéica do extrato bruto por sulfato de amônia 0-90%.A determinação in vitro de atividade enzimática de proteases cisteínicas não mostrou a presença destas nas amostras. Em contraste, as eletroforeses detectaram atividades enzimáticas para todas elas e com perfis diferentes. Em relação à fervura, Albizia sp. não apresentou perda de atividade da única banda; em C. arietinum houve uma perda massiva de atividade das duas bandas já após 2 min de fervura e em L. culinaris, ocorreu perda de uma e manutenção de duas das três bandas. Atividade dos sobrenadantes da precipitação salina contra substratos sintéticos foi encontrada apenas para o substrato da caspase 3, a qual foi completamente inibida na presença do inibidor Ac-DEVD-al.Bandas de atividades de proteases cisteínicas foram detectadas nos tegumentos de todas as sementes estudadas e atividade caspase 3-símile, inibida por inibidor específico, foi detectada em Albizia sp. e L. culinaris.