INDUÇÃO DE APOPTOSE EM CÉLULAS EMBRIONÁRIAS DE RHIPICEPHALUS (BOOPHILUS) MICROPLUS (BME26) POR INIBIÇÃO DA VIA DE SINALIZAÇÃO POR INSULINA

Autores

  • Bárbara Della Noce
  • Leonardo Abreu
  • Arianne Fabres
  • Renato Damatta
  • Carlos Logullo

Palavras-chave:

Apoptose, BME26

Resumo

A via de sinalização por insulina é importante por seu papel no metabolismo e por promover a sobrevivência celular. A inibição farmacológica desta via é capaz de induzir apoptose em alguns tipos celulares. Esse trabalho descreve eventos relacionados a indução de apoptose nas células BME26, e a possibilidade deste sinais apoptóticos ocorrerem com a inibição de dois componentes da via de sinalização por insulina: a PI3K inibida por LY294002 e wortmanin; e a AKt, por 10-DEBC.A BME26 foi mantida na estufa 34ºC, com meio de cultura Leibovit’s (Esteves et al., 2008). Nessas células, foi feita a citometria de fluxo para avaliar granulosidade e tamanho celular; exposição à luz UV em 5, 10, 15 e 20 min; para avaliar a indução de apoptose; incubação com inibidores LY, wortmanin e 10-DEBC em diferentes concentrações com base no IC50; e MTT, para observar a viabilidade celular. Na avaliação morfológica foi utilizada microscopia óptica (coloração pelo método de Giensa) e de fluorescência (por Br. de Etídeo e Laranja de Acridina). Foi examinado também, a exposição da fosfatidil-serina marcada pela anexina-V e a detecção da ativação de caspases-3 (colorimétrico).Dentre os tempos de exposição ao UV, um grau maior de apoptose foi estabelecido em 10 minutos de exposição, com incubação (na estufa 34ºC) de 24hs, as células apresentaram retração citoplasmática, aparente redução de seu conteúdo, e muitos fragmentos. No caso dos inibidores, o 10-DEBC se destacou por ter uma maior indução apoptotica. Esses experimentos foram quantificados, em células viáveis, células apoptóticas e células necróticas. Para avaliar estes resultados utilizamos a microscopia. Como confirmação de ocorrência da apoptose nas situações citadas acima, Observou-se a exposição da fosfatidil-serina e a ativação de caspases-3.Estabelecida a apoptose na BME26, foi possível comparar se o mesmo ocorreria ao inibir a via de SIn através do uso de inibidores. Posteriormente o estabelecimento do silenciamento da AKt serviria para comparar com os resultados do inibidor de AKt, ou axiliar em outros projetos.

Publicado

04-04-2012