Adaptação de um protocolo para a Purificação da Proteína Dissulfeto Isomerase (PDI) de espermatozóides de mamíferos.

Resumo

A proteína dissulfeto isomerase é um importante componente da via de síntese e manutenção da estrutura e funcionalidade de proteínas em eucariotos, através da redução, isomerização e oxidação de grupamentos tióis (SH). Este trabalho tem como finalidade a purificação da proteína dissulfeto isomerase através da adaptação e padronização do protocolo estabelecido por Hilson et al, 1984. Para tanto, extratos protéicos de espermatozóides epididimários foram obtidos através de ciclos de sonicação. Após a centrifugação do homogenato, as proteínas solúveis foram submetidas a um tratamento de desnaturação por calor (70ºC – 5min). A amostra, posteriormente, sofreu fracionamento com sulfato de amônio a diferentes concentrações (55% e 90% de saturação). Após cada um dos dois processos a amostra foi centrifugada e seu pellet descartado, o que representa uma grande redução protéica. A partir desta etapa, as amostras foram submetidas a diferentes tipos de cromatografias: troca aniônica fraca (DEAE), troca aniônica forte (Resource Q®) e fase reversa (C18). Todas as etapas de purificação foram monitoradas através de eletroforeses desnaturantes. Com a utilização de uma coluna DEAE de troca aniônica, o perfil mostrado na eletroforese em gel demonstra um enriquecimento da banda de aproximadamente 55 kDa em pelo menos 5%. Na cromatografia de troca aniônica forte são observadas duas bandas onde a proteína de 65kDa apresentou um enriquecimento superior a 12%. E a cromatografia de fase reversa C18, apresenta um perfil eletroforético de apenas duas bandas, uma delas com peso de 61,67KDa apresentando um enriquecimento superior a 15% e uma de peso 70,80KDa com um enriquecimento superior a 47%. O processo de purificação ainda está sendo aprimorado e posteriormente espera-se avaliar a atividade desta enzima em espermatozóides imaturos e maduros obtidos de diferentes regiões do epidídimo de Equus caballus.