ANÁLISE DA REGULAÇÃO DO PROMOTOR salT, EM Arabidopsis thaliana, ATRAVÉS DE EXPRESSÃO TRANSIENTE E TRANSFORMAÇÃO ESTÁVEL VIA Agrobacterium tumefaciens

Resumo

A adaptação de plantas aos estresses abióticos depende da ativação de mecanismos envolvidos na percepção do estresse, transdução do sinal e expressão de genes. O estudo de expressão e caracterização de promotores em plantas tem permitido identificar novas regiões regulatórias com potencial aplicação na construção de vetores de expressão. Um forte candidato é o promotor que regula a expressão do gene salT, envolvido em um mecanismo global de resposta a estresses ambientais.O estudo desse promotor revelou que uma região de 256 pb provavelmente contém os principais sítios de ligação para fatores de transcrição que o ativam. Para avaliar a aplicabilidade dessa região, bem como a influência do íntron salT, três vetores repórteres foram construídos: “região de 256 pb + gene GUS”; “região de 256 pb + íntron salT + gene GUS”; “região de 256 pb + íntron Act1 + gene GUS”. Tais construções foram eletroporadas em A.tumefaciens e as culturas de células foram tratadas com tampão, cuja composição contém o substrato para a enzima betaglucoronidase, codificada pelo gene GUS. Assim, é possível a detecção de uma coloração azul intensa, caso o gene GUS esteja sendo expresso. Nesse teste, as três construções apresentaram resultado negativo quanto à coloração, visto que o promotor do gene salT é regulado somente em plantas. Como controle positivo, A. tumefaciens contendo o plasmídeo pA19-GUS-K foi submetida ao mesmo teste. Uma vez que tal plasmídeo contém o promotor constitutivo 35S, foi possível a detecção da coloração. A. tumefaciens selvagem foi utilizada como controle negativo. A partir desse resultado, as cinco cepas de A. tumefaciens foram utilizadas para a realização de testes de expressão transiente, em tecido foliar de plantas jovens de A. thaliana. O gene GUS teve maior expressão nas folhas infectadas com os vetores contendo íntrons. Contudo, os ensaios de transformação genética indireta, mediada por A. tumefaciens, foram conduzidos em plantas de A.thaliana, utilizando o controle positivo e o vetor “256pb + gene GUS”, já que este apresentou o maior nível de expressão, com o intuito de obter mutantes para tais construções.