SUPEREXPRESSÃO DE UMA PROTEÍNA TRANSPORTADORA DE LIPÍDEOS OBTIDAS DE SEMENTES DE FEIJÃO-DE-CORDA (Vigna unguiculata L.) EM Escherichia coli

  • Flávia Camila Vieira da Silva
  • Valdirene Moreira Gomes
  • André de Oliveira Carvalho
Palavras-chave: LTP, superexpressão, purificação

Resumo

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são componentes da imunidade inata dos organismos e desempenham importante papel na defesa do hospedeiro contra infecções. Pesquisadores os apontam como potenciais agentes quimioterápicos. Muitos AMPs foram caracterizados de plantas e sementes, tendo estes uma importante participação na defesa de plantas contra fitopatógenos. Entre eles estão as proteínas transportadoras de lipídeos (LTP) que são AMPs pequenos, básicos e ricos em cisteínas que possuem atividade antimicrobiana. O objetivo deste projeto será estudar os efeitos antiparasíticos da LTP de sementes de feijão-de-corda, obtidos de modo recombinante, em diferentes espécies de Leishmania sp. e em Trypanosoma cruzi, os quais causam doenças com grande impacto social no Brasil e em outros países. O método utilizado foi baseado na superexpressão e purificação da LTP recombinante em sistema procarioto. A E. coli contendo o plasmídeo pET-LTP2 foi inoculada em caldo LB e incubadas por 16 h a 37°C. Uma alíquota da cultura bacteriana foi transferida para o mesmo meio e incubada nas mesmas condições até a DO600 ficar entre 0,5-1. Foi então adicionado IPTG 0,01 Me a cultura foi incubada na mesma condição por mais 3 h. Para a extração da LTP as bactérias foram centrifugadas (10.000 g/10 min) e sonicadas (5 pulsos de 20 s), o sobrenandante foi aquecido a 80ºC por 15 min e novamente centrifugado (10.000 g/10 min). Este extrato foi aplicado na Ni-Sepharose (GE) e o procedimento de purificação feito de acordo com o manual da coluna. As amostras foram dialisadas, o conteúdo protéico foi dosado (Bradford, 1976) e estas foram acompanhadas por eletroforese(Laemmli, 1970). O procedimento está sendo repetido várias vezes para acumulação do material. Os resultados preliminares mostram que a indução foi eficiente e que as amostras de LTP2 cromatografadas na coluna Ni-Sepharose foram separadas em 2 picos e a eletroforese mostrou que esta fração está enriquecida com o AMP recombinante.

Biografia do Autor

Flávia Camila Vieira da Silva
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos, CBB, UENF, Campos dos Goytacazes-RJ.
Valdirene Moreira Gomes
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos, CBB, UENF, Campos dos Goytacazes-RJ.
André de Oliveira Carvalho
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos, CBB, UENF, Campos dos Goytacazes-RJ.