PURIFICAÇÃO PARCIAL DA RICINA PARA UTILIZAÇÃO COMO PADRÃO EM TESTES DE TOXICIDADE.

  • Renata Barreto Sá
  • Keysson Vieira Fernandes
  • Olga Lima Tavares Machado
Palavras-chave: Ricina, Mamona, Toxicidade

Resumo

A ricina e uma proteína tóxica encontrada no endosperma das sementes de mamona (Ricinus communis). Esta proteína (66 kDa) é formada por duas cadeias, a cadeia A (32 kDa) que possui atividade enzimática inibidora de ribossomos, e a cadeia B (34 kDa) que tem função lectina. Sendo conhecida a forma de detecção da ricina em cultura de células, temos como objetivo no presente trabalho o isolamento desta proteína para utilização como padrão na análise de outras toxinas vegetais. As sementes de mamona (IAC-226) foram lavadas e trituradas em tampão PBS pH 7,0. A mistura foi mantida em agitação por 3 horas para a extração de proteínas totais. Após a extração, a solução foi centrifugada por 20 minutos a 22.000 G e o sobrenadante foi coletado. Foi feita uma precipitação de proteínas com sulfato de amônio à 0-90%, 0-60% e 0-40%. Foi feita uma centrifugação por 20 minutos a 22.000 G e o precipitado foi então coletado e ressuspendido. A concentração de proteínas foi estimada pelo método de Bradford (1976). Foi feita cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-50. As frações coletadas da exclusão molecular foram analisadas em SDS-PAGE 12% (LAEMMLI, 1970). Pela dosagem de proteínas e através de análise qualitativa por eletroforese verificamos que os extratos de material precipitado(principalmente o 0-90% de saturação) contêm a maior concentração de proteínas. O precipitado 0-90% foi utilizado na cromatografia e foram submetidas à leitura em espectrofotômetro (280 nm). Foram isoladas três frações e cada uma delas foi analisada por eletroforese. Observamos então que a F1 possuía uma banda majoritária com massa molecular semelhante às cadeias A e B da ricina. Também foram vistas proteínas com peso molecular de aproximadamente 50 kDa, o que mostra que F1 não correspode a ricina pura, necessitando de novos passos para purificação desta toxina. Concluimos que a purificação parcial da ricina, para seu posterior uso como padrão em teste de citotoxicidade para outras proteínas tóxicas, apesar de excluir grande parte das proteínas presentes no extrato bruto, ainda necessita de outras etapas para obtermos a toxina pura.
Publicado
19-04-2013