SUPEREXPRESSÃO EM ESCHERICHIA COLI DE UMA DEFENSINA RECOMBINANTE DE FEIJÃO-DE-CORDA E SUA PURIFICAÇÃO

  • Géssika Silva Souza
  • Valdirene Moreira Gomes
  • André de Oliveira Carvalho
Palavras-chave: Defensina recombinante, Purificação, superexpressão

Resumo

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) participam da imunidade inata dos organismos e são apontados com grande potencial de serem novas drogas para tratamento de doenças infecciosas. As defensinas são AMPs pequenos, básicos, ricos em cisteínas e que possuem atividade antimicrobiana. O objetivo deste projeto, nesta etapa, é padronizar a purificação da defensina recombinante. E. coli contendo o vetor pET-DEF foi crescida em meio LB e TB (37ºC, 16h), uma alíquota foi transferida para o mesmo meio e incubada nas mesmas condições até DO600 atingir 0,7. Foi adicionado IPTG 1mM e a cultura foi incubada (30°C, 3h). A extração foi feita do sedimento de células por sonicação com e sem Triton-X 1%, o sobrenadante, clarificado por centrifugação, foi aplicado na coluna Ni-NTA agarose, para purificação. A defensina recombinante (DEFr) obtida na purificação foi clivada com Enterokinase 0,02u e em seguida aplicado na Ni-NTA agarose. O primeiro pico dessa cromatografia foi aplicado na coluna C8C18. Todos os passos foram acompanhados da dosagem por Bradford e de eletroforese. A indução feita em meio TB com Triton-X 100 ficou melhor e após análise em gel, mostrou uma banda superexpressa com massa correspondente à DEFr. A purificação com a coluna de Ni-NTA agarose nos permitiu separar a DEFr com alguns contaminantes, mesmo assim foi feita a clivagem com a Enterokinase. O gel mostrou que a clivagem foi bem sucedida. Em seguida foi possível separar a DEFr, já clivada, da cauda de histidina com a coluna Ni-NTA agarose. Para separar os contaminantes da DEFr clivada foi utilizada a coluna de fase reversa C8C18. O gel mostrou uma banda com massa correspondente à DEFr. O procedimento está sendo repetido para acúmulo do material para fazer os testes antimicrobianos. As condições de indução em meio TB e extração na presença de Triton-X 100 se mostraram mais eficientes. Os resultados mostram que a purificação, pré-clivagem e pós-clivagem, ocorreu de forma eficiente. O uso da coluna de fase reversa C8C18 para a separação da DEFr dos contaminantes foi bem sucedida.
Publicado
22-04-2013