SUPEREXPRESSÃO EM ESCHERICHIA COLI DE UMA PROTEÍNA TRANSPORTADORA DE LIPÍDEOS RECOMBINANTE DE FEIJÃO-DE-CORDA E SUA PURIFICAÇÃO

  • Flávia Camila Vieira da Silva
  • Valdirene Moreira Gomes
  • André de Oliveira Carvalho
Palavras-chave: LTP recombinante, Purificação, Superexpressão

Resumo

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) apresentam papel importante na primeira linha de defesa de organismos contra patógenos. AMPs são considerados por pesquisadores potenciais agentes terapêuticos. Entre estes estão as proteínas transportadoras de lipídeos (LTP) que são pequenas, possuem carga líquida positiva em pH fisiológico, ricas em cisteínas e possuem atividade antimicrobiana. O objetivo deste trabalho, nesta etapa, é padronizar a purificação da LTP recombinante de sementes de feijão-de-corda. E. coli contendo o vetor pET-LTP foi inoculada em caldo LB e TB e incubada (16 h, 37 °C). O pré-inoculo foi transferido para o mesmo meio e incubado nas mesmas condições até a DO600 atingir 0,7. Foi adicionado IPTG 1 mM e a cultura foi incubada (30 °C, 3 h). O sedimento de bactérias foi sonicado com e sem Triton X-100, o sobrenandante foi centrifugado e purificado na coluna Ni-NTA agarose. Durante a cromatografia foram obtidos dois picos. A LTPr, contida no P2, teve a cauda de histina clivada pela enterokinase. Após clivagem foi novamente purificada na coluna Ni-NTA agarose. Para retirar as impurezas remanescentes o pico contendo a LTPr clivada foi submetido à coluna de fase reversa C8/C18. Os resultados mostram que a indução e a extração da LTPr apresentaram resultados satisfatórios em meio TB com Triton-X 100 após observação em gel de tricina. A purificação na coluna de Ni-NTA agarose foi eficiente, porém a amostra contendo a LTPr apresentava alguns contaminantes. Na clivagem a enterokinase mostrou-se eficiente no reconhecimento do sítio de clivagem na cauda de histidina da LTPr. A amostra clivada foi recromatografada na mesma coluna e em gel mostrou que o procedimento foi eficiente, porém ainda é possível observar alguns contaminantes. A cromatografia de fase reversa em coluna C8/C18 apresentou excelente resultado na purificação da LPTr após clivagem. Conclui-se que a indução em meio TB e a extração com Triton X-100 permitiram a padronização destas etapas do processo. A purificação na coluna de Ni-NTA agarose mostrou a presença de contaminantes, antes e depois da clivagem da LTPr, que foram eliminados na coluna de fase reversa.
Publicado
03-05-2013