PARÂMETROS PARA ELETROPORAÇÃO DE OVÓCITOS BOVINOS PARA INTERNALIZAÇÃO CITOPLASMÁTICA DE TREALOSE

  • Janaina Leite Pereira
  • Carla Sobrinho Paes de Carvalho
  • Edgar Maurício Mogollon Waltero
  • Rogério Figueredo Daher
  • Angelo José Burla Dias
Palavras-chave: Maturação in vitro, eletropermeabilização, viabilidade oocitária

Resumo

Os resultados de criopreservação de ovócitos bovinos são ainda muito baixos, em parte devido a elevada toxicidade das soluções crioprotetoras. Uma alternativa tem sido o uso de crioprotetores de baixa toxicidade, como a trealose, um açúcar impermeável à membrana plasmática. A eletroporação é uma técnica que possibilita a introdução desse açúcar no ooplasma. O estudo teve como objetivo avaliar diferentes parâmetros de eletroporação de oócitos e sua ação sobre a viabilidade ovocitária Ovócitos aspirados de ovários obtidos em abatedouros locais foram maturados in vitro, desnudados e eletroporados em placa (450, BTX) em 20 l de solução de eletroporação ( 0,1 mM de sulfato de magnésio, 150 mM dem trealose e 140 mM de manitol). Foram comparados dois protocolos de eletroporação: T1 (4 pulsos de 2 mS, 40 V) e T2 (5 pulsos de 60 mS, 130 V). Após a eletroporação os ovócitos foram marcados com iodeto de propídio (PI) (10 mg / mL em PBS) e analisados aos 5 min. (verificar abertura de poros) e 30 min (verificar fechamento dos poros). A viabilidade ovocitária foi avaliada com Calceina AM (1 mg / mL), aos 30 min. após a eletroporação. Aos 5 min. após eletroporação, foi observada diferença significativa na porcentagem de ovócitos marcados com PI (T1: 75% e T2: 100%). Porém, após 30 min. não houve diferença significativa entre os tratamentos (T1: 15 % e T2: 35 %). A avaliação da viabilidade celular com Calceina AM mostrou que oócitos de T1 apresentaram maior viabilidade do que os do T2 (84% e 43,1%, respectivamente) de acordo com o teste de proporção e intervalo de confiança (P <0,05). Os resultados apresentados indicam maior taxa de permeabilização da membrana promovido pelo tratamento 1, aos 5 min. Porém T2 foi capaz de promover a abertura de poros na membrana, com menor impacto sobre a sua viabilidade ovocitária. Conclui-se que o tratamento 2 , apesar de apresentar menor taxa de permabilização de membranas , causou menos danos para os oócitos com conseqüente maior viabilidade.
Publicado
14-05-2013