CLIVAGEM DO ECTODOMÍNIO DE CD44 E SECREÇÃO DE MMP9 EM MACRÓFAGOS INFECTADOS PELO TOXOPLASMA GONDII

  • Sara Hellen Santos Schuindt
  • Daniele Seipel da Silva
  • Andrea Cristina Vetö Arnholdt
Palavras-chave: Toxoplasma gondii, Metaloprotease, MT1-MMP

Resumo

O Toxoplasma gondii é capaz de usar células do sistema imunológico, tais como macrófagos, células dendríticas e NK para sua disseminação no organismo hospedeiro, atingindo sítios imunoprivilegiados como cérebro e retina. Os mecanismos moleculares envolvidos na migração das células infectadas e de sua transmigração através da hemato-encefálica não são conhecidos. As células infectadas devem ser capazes de sintetizar, expressar e secretar metaloproteases de matriz, que medeiam a proteólise de componentes da matriz extracelular e a afinidade-avidez de integrinas como ?v?3. O objetivo deste trabalho é investigar se o T. gondii é capaz de modular a expressão de componentes da maquinaria de invasão tecidual, utilizada por células tumorais, na célula hospedeira. Para tal, macrófagos murinos da linhagem Raw 264.7 são infectados com T. gondii em uma proporção de 5:1 parasita:célula, e cultivadas em estufa de 5% CO2, 37°C, em DMEM (2% SFB), e podem receber diferentes tratamentos previamente à infecção. Para a análise da cooperação dos receptores TLR, 10 ng/ml de LPS são adicionados ao meio de cultura por 60 minutos antes da adição do parasita. Para análise das vias de sinalização intracelular e da ação de metaloproteinases nos processos de maturação das formas pro-MMP9 ou de liberação do ectodomínio de CD44 são utilizados inibidores da via ERK (u0126, 10uM) ou MMP inhibitor I (150uM) adicionado a co-cultura após 30 minutos de infecção. Após 18-24 h de infecção, as células são lavadas, fixadas e incubadas com anticorpos primários para CD44, que são evidenciados por um sistema de amplificação com streptoavidina-PE ou PECy5.5, e analisadas por citometria de fluxo. Sobrenadantes das culturas são imunoprecipitados com anti-CD44 e analisados por zimografia pra a presença de MMP9. Resultados preliminares sugerem que o T. gondii induz a diminuição da expressão de CD44 e é observado um aumento da forma ativa da molécula de MMP9 no sobrenadante das células infectadas. A participação da via das ERK e da utilização de MT1-MMP e de ADAM10 na conversão de pro-MMP9 está sob análise.