INDUÇÃO DE APOPTOSE EM CÉLULAS EMBRIONÁRIAS DE RHIPICEPHALUS (BOOPHILUS) MICROPLUS BME26 POR INIBIÇÃO DA VIA DE SINALIZAÇÃO POR INSULINA

  • Bárbara Della Noce
  • Leonardo Abreu
  • Carlos Logullo
Palavras-chave: Células embrionárias BME26, Apoptose, Sinalização por insulina

Resumo

Além do seu papel no metabolismo, a sinalização por insulina (SIn) também promove a sobrevivência celular. A inibição farmacológica da SIn é capaz de induzir apoptose em alguns tipos celulares. Esse processo é marcado por modificações bioquímicas e morfológicas. Inibidores seletivos tem sido usados na caracterização desta via de sinalização na linhagem BME26. Este trabalho objetiva a padronização de metodologias capazes de induzir um padrão positivo de morte por apoptose nas células BME26. As células foram mantidas a 34ºC em meio de cultivo Leibovitz 15B. A morte celular por apoptose foi induzida pela retirada de glicose ou soro fetal bovino do meio, expondo as células ao peróxido de hidrogênio (H2O2), à radiação ultravioleta (UV) e a inibidores seletivos de 2 componentes da SIn: PI3K (LY294002 e Wortmanina) e PKB (10- DEBC). As alterações morfológicas induzidas pelos tratamentos foram avaliadas por microscopia ótica (coloração por Giemsa) e de fluorescência (coloração por EtBr), e por citometria de fluxo (avaliação de granulosidade e tamanho). Adicionalmente, viabilidade das células foi também avaliada pela coloração por EtBr/AO. De um modo geral, os tratamentos realizados promoveram alterações morfológicas como a retração do citoplasma, a diminuição do número de vesículas citoplasmáticas, a fragmentação do núcleo, e o aparecimento de projeções citoplasmáticas similares a corpos apoptóticos. Foi observado que a exposição prolongada (24hs) aos inibidores da seletivos induziu modificações similares. Esses dados se baseiam numa análise qualitativa e inicial. Resultados quantitativos preliminares sugerem que a exposição ao UV provocou efeitos dose-depedentes nas alterações morfológicas observadas. Dentre os tratamentos utilizados inicialmente, a exposição ao UV pareceu o mais promissor para a indução de morte por apoptose em células BME26, e utilização como um padrão positvo. Os próximos passos incluem a quantificação da apoptose nesses tratamentos, determinação da atividade de caspase, exposição de fosfatidilserina e fragmentação nucleossomal. Estudos mais aprofundados ainda são necessários para a caracterização dos eventos de apoptose na linhagem BME26.