PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE CISTATINAS DE CLITORIA FAIRCHILDIANA

Resumo

Cistatinas são proteínas capazes de inibir o crescimento de fungos e a digestão de insetos fitófagos, sugerindo potencial antimicrobiano e inseticida. Tais proteínas são candidatas a agentes terapêuticos no tratamento de doenças fúngicas animais e na defesa de plantas contra predadores. Como a relação de especificidade proteína x organismo-alvo é muito alta, nosso trabalho objetiva isolar, caracterizar e testar os potenciais de cistatinas de C. farchildiana contra fungos e insetos específicos. Farinha de cotilédones de C. farchildiana foi despigmentada com metanol 80% (1:5 p/v; 15 min) e submetida à extração de proteínas com tampão fosfato de sódio 0,1M NaCl 0,5M, pH 7,6 (1:10 p/v), por 90 min. O sobrenadante da centrifugação (12.000 xg, 15 min), ou extrato bruto (EB), teve seu teor protéico medido, segundo Bradford (1976). EB foi sujeito à cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-100, equilibrada com fosfato de sódio 100mM, pH 7,6. As frações coletadas foram lidas em espectrofotômetro a 280nm e sujeitas a ensaio de atividade de inibição de papaína (protease controle), segundo Michaud et al. (1990). As amostras foram visualizadas por SDS-PAGE, segundo Laemmli (1970). No presente trabalho, após submetermos o extrato bruto de C. fairchildiana a uma cromatografia de exclusão molecular foram identificados 3 picos protéicos, referidos como P1, P2 e P3, que apresentaram os seguintes teores protéicos (P1 = 70,1%; P2 = 15,5%; P3 = 14,4%). Quanto à atividade inibitória de papaína, o pico 2 apresentou maior potencial inibitório (20%) que os demais picos (P1=15%; P3=10%). Por eletroforese, foram visualizadas em P1, bandas majoritárias de proteínas oligoméricas de reserva, tipicamente vicilinas de espécies de leguminosas, com massas moleculares entre 66 e 45 kDa. Já em P2 a principal banda foi de aproximadamente 15 kDa. Não foram visualizadas bandas protéicas em P3. Cistatinas foram detectadas nos cotilédones da semente C. fairchildiana. O processo de purificação, em curso, sugere a existência de diferentes isoformas, de diversas massas moleculares. Uma cromatografia de afinidade em CnBr-Sepharose CM-papaína será usada como próximo passo de purificação.