EXPRESSÃO E ATIVAÇÃO DE METALOPROTEINASES DE MATRIZ EM MACRÓFAGOS MURINOS INFECTADOS PELO T. gondii

Resumo

O Toxoplasma gondii é capaz de usar células do sistema imunológico, tais como macrófagos, células dendríticas e NK para sua disseminação no organismo hospedeiro, atingindo sítios imunoprivilegiados como cérebro e retina. Os mecanismos moleculares envolvidos na migração das células infectadas e de sua transmigração através da hemato-encefálica não são conhecidos. As células infectadas devem ser capazes de sintetizar, expressar e secretar metaloproteinases de matriz, que medeiam a proteólise de componentes da matriz extracelular e a afinidade-avidez de integrinas como ?v?3. O objetivo deste trabalho é investigar se o T. gondii é capaz de modular a expressão de componentes da maquinaria de invasão tecidual, utilizada por células tumorais, na célula hospedeira. Para tal, macrófagos murinos da linhagem Raw 264.7 são infectados com T. gondii em uma proporção de 5:1 parasita:célula, e cultivadas em estufa de 5% CO2, 37°C, em DMEM(10% SFB), e podem receber diferentes tratamentos previamente a infecção. Para a análise da cooperação dos receptores TLR, 10 ng/ml de LPS são adicionados ao meio de cultura por 60 minutos antes da adição do parasita. Para análise das vias de sinalização intracelular e da ação de metaloproteinases nos processos de maturação das cadeias alfa de integrina são utilizados inibidores da via ERK (u0126, 10uM) ou MMP inhibitor I (150uM) adicionado a co-cultura após 1 h de infecção. Após 18-24 h de infecção, as células são lavadas, fixadas e incubadas com anticorpos primários para ADAM10 ou MT1-MMP, que são evidenciados por um sistema de amplificação com streptoavidina-PE ou PECy5.5, e analisadas por citometria de fluxo. Extratos celulares são obtidos e avaliados por western blotting para as formas de zimogênio e processadas destas metaloproteinases de matriz. Resultados preliminares sugerem que o T. gondii induz um aumento da expressão de ADAM10 e de MT1-MMP, que se encontram na sua forma ativa. A via de sinalização das ERK não parece estar envolvida neste aumento de expressão. Já o processamento em formas maduras destas enzimas parece envolver furina ou pro-proteina convertases.